微课堂牛结节性皮肤病检测诊断技术

牛结节性皮肤病（lumpyskindisease，LSD）又称牛疙瘩皮肤病或牛结节疹，是由痘病毒属的结节性皮肤病病毒引起，以发热、淋巴结肿大、皮肤广泛性结节和溃疡性病变为主要特征，发病率在5%～45%，病死率达10%。该病可引起牛体重增长缓慢、产奶量降低、不孕或不育、皮革损害等，对养殖场造成了巨大的经济损失。

1

疾病发生

该病起初是在年赞比亚北部发现，当时并不清楚疾病的病因。随后，年10月，贝专纳保护国（博茨瓦纳）也发生了一起类似的疫情，此次仍然没有对该病进行描述。直到年，南罗得西亚（southernRhodesia）和南非发生此病，被ThomasandMaré命名为疙瘩状皮肤病。年该病在东非的肯尼亚被诊断为结节性皮肤病，Alexander等（）首次从组织中分离出感染的病毒。随后多个国家和地区出现了此病的报道，我国是在年8月首次在新疆伊犁哈萨克自治州确诊发生牛结节性皮肤病，此次统计发病比例为17.0%～36.2%，病死比例为0.8%。LSD的发生具有明显的季节性，常见于吸血节肢动物利于繁殖的春、夏、秋季节。Yeruham等（）研究认为牛结节性皮肤病是由昆虫媒介或运输车辆携带病毒传播，另外被病毒污染的食物、共用水槽或者被血液污染的针头等也可能是此病传播的途径。所有品种和年龄的牛均易感，小牛易感性更高。

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病原

LSD的病原是牛结节性皮肤病病毒（lumpyskindiseasevirus，LSDV）。LSDV是一种痘病毒，其形态和抗原与牛痘病毒差异很大，而与绵羊痘病毒（sheeppoxvirus，SPPV）和山羊痘病毒（goatpoxvirus，GPV）相似，同属于山羊痘病毒属。LSDV是双链DNA含有囊膜的病毒，在pH6.6-8.6之间稳定；在冬季和干燥情况下，该病毒在环境中存活能力很强。此病毒容易被洗涤剂十二烷基硫酸钠灭活，并且对氯仿和乙醚敏感。虽然很多消毒剂能够杀灭该病毒，但这些消毒剂往往难以杀灭发病动物脱落的痘疹痂皮中的病毒。在感染该病的病牛中，病毒主要存在于皮肤结节、皮损痂、血液、唾液、鼻分泌物、精液和牛奶中（Weiss,年）。LSDV不感染人类。

3

临床诊断

3.1

临床症状

自然感染LSD病例，潜伏期2～4周，而实验感染病例潜伏期4～14d。动物感染后出现持续性发热表现，同时伴随着精神沉郁、食欲不振、流涎、流泪，以及黏液性或脓性鼻液，浅表淋巴结肿大。动物发烧2d内，皮肤可能会出现结节状病变，有的病例只表现几个结节，有的病例却全身覆盖，多发生在头、颈、会阴、生殖器、乳房和四肢等部位，结节直径在5～50mm，边界分明，坚固，呈圆形，隆起，累及皮肤、皮下组织，有时甚至累及皮下肌肉。结节可能会发生破溃，继发感染，也可能持续性存在。

一些急性感染的病例可能会在身体的腹侧部分，如胸部、四肢、乳房、阴囊和外阴等发生严重的皮下水肿。水肿的皮肤可能会坏死脱落，发生溃疡，并可能继发细菌感染。有的乳房水肿和坏死性病变，从而导致乳腺炎。公牛通常会暂时不育，但如果伴有严重的睾丸炎，可能会永久性不育。还有些病例的气管和肺部出现坏死病变，导致肺炎的发生。

皮肤结节疹

溃疡

3.2

病理变化

患畜口、鼻孔、口腔粘膜、消化道和呼吸道、外阴和包皮上可能出现软而黄灰色结节或溃疡性病变。急性病例出现四肢和腹部皮下水肿和全身淋巴结肿大。皮肤结节的切面呈灰白色，质地坚实。最终，皮肤结节中央可能坏死、脱落，形成颗粒状溃疡。此外，还可能发生血管炎、血栓、淋巴管炎、坏死和梗死。坏死区域被中性粒细胞、巨噬细胞和嗜酸性粒细胞浸润，后来被淋巴细胞、浆细胞、巨噬细胞和成纤维细胞所取代。胞浆内嗜酸性包涵体主要见于皮肤中的巨噬细胞、内皮细胞、周细胞和角化细胞，但也见于与毛囊相关的上皮细胞、皮肤腺体和平滑肌细胞。

本病根据临床症状可进行初步诊断，但临床上假性块状皮肤病（由牛疱疹病毒引起）、昆虫叮咬、蠕形螨感染、盘尾丝虫病、贝斯诺原虫病和嗜皮菌病等易与LSD混淆，因此确诊还需通过实验室检测诊断。

4

检测诊断标准

4.1

检测诊断标准

表1检测诊断标准

序号

标准

实施日期

发布部门

1

SN/T-牛结节疹检疫技术规范

.9.16

中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局

2

SN/T-牛结节疹病毒荧光定量PCR操作规程

.7.1

中华人民共和国海关总署

4.2

实验室检测方法

4.2.1电镜观察法

取新鲜的皮肤结节，制备组织悬液，用投射电镜观察。山羊痘病毒粒子如砖状，周围覆盖有短管状结构，大小约为（×）nm，有些病毒粒子周围有宿主细胞膜包围。实际上，山羊痘病毒很难与正痘病毒区别，且其形态学上与牛痘和痘病毒没有区别，但牛很少发生痘病毒和牛痘病毒感染，也不引起全身性感染，其他正痘病毒则均不引起牛发病。而副痘病毒在电镜下其形态小于痘病毒，呈卵圆形，外面有单个连续管状结构，像沟槽覆盖在病毒粒子周围，能与牛型山羊痘病毒区分开来。

4.2.2病原学检测

进行病毒分离，可采集血液或组织。采集出现全身病灶4d内牛的抗凝血，离心取上清液中含病毒的血沉棕黄层；或采集出现临床症状一周内的皮肤结节、肺病灶、淋巴结及病灶周围组织，制成匀浆液，分别接种于羔羊睾丸细胞（LT细胞）培养。连续14d观察细胞病变（CPE）。CPE特征是细胞膜皱缩到细胞圆缩，核染色体边缘化。最初看到小面积的CPE，4～6d波及整个细胞层。14d后如未发现CPE，培养物应该冻融3次，取上清液接种新鲜的LT细胞并做二次培养。如出现CPE征兆，则进行特异性鉴定。即取培养物用丙酮进行固定，HE染色。由于山羊痘病毒在细胞内产生特异性的CPE和胞浆内包涵体，所以当看到相当于细胞核的一半、大小不一、且周边有清晰晕的呈亮红色嗜酸性细胞浆内包涵体，即可诊断为痘病毒感染。

4.2.3血清学检测

采集患牛血液制备血清，以LSD阳性血清和阴性血清作对照，进行血清中和实验。中和滴度大于等于1:5为阳性，小于1:5为阴性，具体操作可参照SN/T-牛结节疹检疫技术规范。

4.2.4聚合酶链反应

聚合酶链反应（PCR）是一种快速、灵敏的检测血液、皮肤和精液中病毒DNA的方法。LSD的荧光定量PCR检测方法。以LSDV国际标准毒株基因序列，设计特异性引物，F：5’-TTGTCAGAAACGAGG-3’，R：5’-ATGCCTCACTTGTATTTGG-3’和一条MGB探针[（FAM）5’-TCTTGCTAAAATACCA-3’（MGB）]。取皮肤、肺、脾脏、淋巴结或肌肉等组织样品，或血液进行核酸提取。以牛结节皮肤病病毒DNA做阳性对照，以不含LSDV的牛肉组织或原代睾丸细胞DNA做阴性对照，以水作空白对照，进行荧光定量PCR反应。

结果判定：Ct值小于等于35，而且出现明显的扩增曲线，判定样品中存在LSDV核酸，无特异性扩增曲线或Ct值大于40，判定样品中无LSDV核酸，而35.0＜Ct值≤40.0的样本重做，重做结果无Ct值且无明显扩增曲线则为阴性，而有Ct值且有明显扩增曲线则为阳性。

主要参考文献：

1.EevaS.M.Tuppurainen.Thedetectionoflumpyskindiseasevirusinsamplesofexperimentallyinfectedcattleusingdifferentdiagnostictechniques.UniversityofPretoriaetd,.

2.SN/T-牛结节疹检疫技术规范

3.SN/T-牛结节疹病毒荧光定量PCR操作规程

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